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REVISTA IMPACTO EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA
Artículo de investigación original
Eficacia in vitro de ácidos orgánicos para el control de Aspergillus
flavus, A. fumigatus y Fusarium verticillioides
Marco Maidana-Ojeda
1,4
, María Graciela Cabrera
2
, Marcelo Esteban Medina-Aquino
3,4
, Guillermo
Andrés Enciso-Maldonado
4
y Jazmín Yerutí Mongelós-Franco
4
*
1
Universidad Autónoma Chapingo. Texcoco, México.
2
Universidad Nacional del Nordeste. Corrientes, Argentina.
3
Universidad Católica Nuestra Señora de la Asunción. Tomás Romero Pereira, Paraguay.
4
Centro de Desarrollo e Innovación Tecnológica. Hohenau, Paraguay.
*Autor de correspondencia: Jazmín Yerutí Mongelós-Franco; yeruti91@gmail.com
Recibido: 09/05/2022 Aceptado: 17/10/2022
Resumen
Las micotoxinas son metabolitos secundarios producidos por los hongos durante la
descomposición de material vegetal. A corto plazo pueden ser tóxicas para plantas y/o
animales, pero el consumo prolongado en bajas concentraciones tiene efecto
inmunosupresor, carcinogénico, mutagénico y teratogénico. El objetivo de este trabajo fue
evaluar la eficacia biológica in vitro del inhibidor conformado por la mezcla de ácido ascórbico
67 %, ácido cítrico 16,5 % y ácido láctico 16,5 %, sobre los hongos micotoxigénicos Aspergillus
flavus, A. fumigatus y Fusarium verticillioides. Se aplicó un diseño experimental
completamente al azar para evaluar la actividad antifúngica del inhibidor utilizando
concentraciones crecientes de 0 (control), 1, 10, 100 y 1.000 ppm en medio de cultivo papa-
dextrosa-agar. Se registró un 100 % de inhibición del crecimiento fúngico para las tres
especies a 1.000 ppm. La inhibición fue significativamente menor a 100 ppm, y se observó un
efecto estimulador del crecimiento en las concentraciones de 1 y 10 ppm en A. flavus y F.
verticilioides, demostrando que el inhibidor conformado por la mezcla de ácido ascórbico al
67 %, ácido cítrico al 16,5 % y ácido láctico al 16,5 % fue altamente eficaz para la inhibición
del crecimiento de los hongos estudiados a concentración de 1.000 ppm.
Palabras clave: micotoxinas, hongos micotoxigénicos, ácido ascórbico, ácido cítrico, ácido
láctico.
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Abstract
Mycotoxins are secondary metabolites produced by fungi during the decomposition of vegetal
materia. In the short term they can be toxic to plants and/or animals, but prolonged
consumption in low concentrations has an immunosuppressive, carcinogenic, mutagenic and
teratogenic effect. The aim of this study was to evaluate the in vitro biological efficacy of the
inhibitor made up of the mixture of ascorbic acid 67%, citric acid 16.5% and lactic acid 16.5%,
on the mycotoxigenic fungi Aspergillus flavus, A. fumigatus and Fusarium verticillioides. A
completely randomized experimental design was applied to evaluate the antifungal activity of
the inhibitor using increasing concentrations of 0 (control), 1, 10, 100 and 1,000 ppm in potato-
dextrose-agar culture medium. There was 100% inhibition of fungal growth for all three species
at 1,000 ppm. The inhibition was significantly lower at 100 ppm, and a growth-promoting effect
was shown at concentrations of 1 and 10 ppm on A. flavus and F. verticilioides, demonstrating
that the inhibitor made of a mixture of 67% ascorbic acid, 16.5% citric acid and 16.5% lactic
acid was highly effective in the growth inhibition of the fungi studied at a concentration of 1,000
ppm.
Keywords: mycotoxins, mycotoxigenic fungi, ascorbic acid, citric acid, lactic acid.
1. Introducción
Las micotoxinas son metabolitos secundarios sintetizados por diversas especies de hongos,
generalmente saprófitos o parásitos débiles, que pueden sobrevivir sobre materia orgánica en
el campo o en productos de almacenamiento. La síntesis de estos compuestos y su liberación
al medio ambiente inhiben el desarrollo de otros microorganismos para favorecer la
proliferación de hongos micotoxigénicos (1, 2, 3). Las micotoxinas se sintetizan principalmente
durante las fases estacionaria y final del desarrollo del hongo, etapas asociadas a la
diferenciación de estructuras reproductivas y esporulación (4). Actualmente, se han
caracterizado alrededor de 300 micotoxinas diferentes (5, 6). Las intoxicaciones producidas
por micotoxinas se denominan micotoxicosis, y pueden constituirse en un problema de salud
animal y humana por la exposición aguda o crónica a alimentos contaminados (7).
Principalmente en intoxicaciones crónicas, las micotoxinas poseen efecto inmunosupresor,
carcinogénico, mutagénico y teratogénico (8). En la producción de micotoxinas se destacan
tres géneros fúngicos, que pueden estar asociados con micotoxinas específicas. El género
Aspergillus comúnmente produce aflatoxinas del tipo B1, M1 y G1, sterigmatocistina y
ocratoxina A. Por otra parte, hongos del género Fusarium son importantes productores de
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fumonisinas, zearalenonas, tricotecenos como deoxynivalenol, toxina T2 y DAS, fusarina y
moniliformina. El género Penicillium está asociado a la síntesis de patulina, citrina y ocratoxina
(9, 10). En Paraguay, recientemente se detectó la ocurrencia de cuatro especies del complejo
F. graminearum, correspondientes a F. graminearum sensu stricto, F. asiaticum, F.
meridionale y F. cortaderiae, identificadas mediante un análisis filogenético de 28 aislados
provenientes de zonas productoras de trigo. El análisis de los quimiotipos reveló que los
aislados de F. graminearum, F. asiaticum y F. meridionale son productores de tricotecenos,
predominantemente deoxinivalenol en su forma acetilada 15-ADON, y nivalenol (11). Las
aflatoxinas inducen efectos mutagénicos asociados al desarrollo de carcinomas hepáticos,
encefalopatías y deterioro visceral. Se ha demostrado que la ocratoxina es causante de
tumores epiteliales, y la fumonisina B1 se relaciona con cáncer de estómago y múltiples
afecciones. La aflatoxina B1 es considerada como el carcinógeno natural más peligroso
conocido (12). La presencia de ocratoxina A fue recientemente reportada en un vino, así como
también deoxinivalenol en cervezas de varias marcas comercializadas en Paraguay (13). Las
micotoxinas que llegan hasta el consumidor final constituyen un problema que comienza
durante la producción de alimentos, y la prevención del crecimiento fúngico es la solución más
factible para controlar la presencia de micotoxinas en los productos finales (14). El uso de
inhibidores fúngicos no influye en el contenido de micotoxinas en los productos agrícolas, sin
embargo, reduce el crecimiento de hongos que las producen (7), y podría ser un método eficaz
para garantizar la producción de alimentos inocuos. Por ello, el objetivo de este estudio fue
evaluar la eficacia biológica in vitro del inhibidor conformado por la mezcla de ácido ascórbico
67 %, ácido cítrico 16,5 % y ácido láctico 16,5 % en concentraciones crecientes, sobre el
crecimiento de Aspergillus flavus, A. fumigatus y Fusarium verticillioides, bajo la premisa de
que, a mayor concentración de inhibidores, mayor es la inhibición del crecimiento fúngico.
2. Materiales y Métodos
Los experimentos se llevaron a cabo en el Laboratorio de Fitopatología de la Universidad
Autónoma Chapingo, ubicado en el km 38,5 de la carretera México-Texcoco, Chapingo,
Texcoco, Estado de México. El periodo de ejecución del estudio estuvo comprendido entre los
meses de mayo y setiembre de 2015. Las unidades experimentales estuvieron constituidas
por placas Petri de 90 mL con 20 mL de medio de cultivo papa-dextrosa-agar (PDA),
dispuestas en un diseño experimental completamente al azar, con 4 repeticiones para cada
especie de hongo en estudio. El experimento fue realizado en duplicado. Los tratamientos
consistieron en concentraciones crecientes de 0 (control), 1, 10, 100 y 1000 ppm del inhibidor
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conformado por la mezcla de los siguientes ácidos orgánicos: ácido ascórbico al 67%, ácido
cítrico al 16,5% y ácido láctico al 16,5%, el cual fue aplicado agregando las diluciones en las
concentraciones correspondientes para cada tratamiento en el medio de cultivo PDA (15), que
se dejó solidificar durante 24 horas. Posteriormente, las placas se inocularon colocando en el
centro un disco de 4 mm de micelio en crecimiento activo de cada hongo en estudio. Las
especies de hongos micotoxigénicos A. flavus, A. fumigatus y F. verticillioides fueron
analizadas en experimentos independientes. Las variables evaluadas fueron el crecimiento
micelial radial (CR) en cm día
-1
, para lo cual se trazó una línea diametral por el centro de la
colonia y se midió el radio de crecimiento micelial cada 48 horas durante 6 días en sentido de
la línea, utilizando un Vernier (precisión = 0,1 mm), y el porcentaje de inhibición de crecimiento
(IC) calculado en base a la reducción del radio de crecimiento de las colonias en cada
tratamiento de acuerdo con el control (Ecuación 1).
IC
%
= 100 -
100 ×
CR colonia tratada
CR colonia control
(Ec. 1)
Los resultados se sometieron a un análisis de varianza y una prueba de Tukey (p > 0,05) para
comparar las medias. Debido a que los resultados de las dos réplicas del experimento en un
primer análisis resultaron similares estadísticamente, se promediaron los resultados de ambos
experimentos para el análisis de varianza final. Se utilizó el software de análisis estadístico
SAS versión 9.3.
3. Resultados y Discusión
Los resultados del crecimiento radial y el porcentaje de inhibición del crecimiento de los
hongos micotoxigénicos A. flavus, A. fumigatus y F. verticillioides sometidos a
concentraciones crecientes del inhibidor se presentan en la Tabla 1. El ANAVA indicó
diferencias estadísticamente significativas entre los tratamientos.
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Tabla 1. Crecimiento radial (CR) del micelio y porcentaje de inhibición del crecimiento (IC) de
hongos micotoxigénicos sometidos a concentraciones crecientes del inhibidor mezcla de ácido
ascórbico 67 %, ácido cítrico 16,5 % y ácido láctico 16,5 %.
Concentración
inhibidor
(ppm)
A. flavus
A. fumigatus
F. verticillioides
CR
(cm día
-1
)*
IC (%)*
CR
(cm día
-1
)
IC (%)
CR
(cm día
-1
)
IC (%)
0
0,49
a
0,00
a
1,41
a
0,00
a
0,88
a
0,00
bc
1
0,54
a
-10,2
a
1,39
a
0,01
a
1,19
b
-35,2
a
10
0,50
a
-2,04
a
1,28
ab
9,21
a
1,02
ab
-15,9
ab
100
0,14
b
71,4
b
1,04
b
26,2
b
0,70
c
20,4
c
1.000
0,00
b
100
b
0,00
c
100
c
0,00
d
100
d
CV (%)**
20,9
54,55
10,88
22,5
10,45
81,8
*Medias con una letra común no son significativamente diferentes por la prueba de Tukey (p>0,05)
**Coeficiente de variación de los datos, en porcentaje
A. flavus no presentó crecimiento micelial a 1.000 ppm del inhibidor (Figura 1), lo que se
tradujo en un 100 % de inhibición del crecimiento a esta concentración, y un 71,4 % de
inhibición a 100 ppm; estas dos concentraciones se diferenciaron significativamente de los
demás tratamientos con menor concentración, los cuales no causaron inhibición del
crecimiento y resultaron estadísticamente similares al control (Tabla 1). Cuando los ácidos
lácticos y cítricos son aplicados por separado, la inhibición del crecimiento de A. flavus no
llega al 50 % en concentraciones de hasta 50.000 ppm (15, 16), sin embargo, la mezcla de
ácido ascórbico 67 %, ácido cítrico 16,5 % y ácido láctico 16,5 % fue eficaz en concentraciones
de 1000 ppm y demostró el efecto sinérgico entre estos componentes, concordando con lo
reportado por León-Peláez et al. (18), quienes evaluaron distintas combinaciones de ácido
láctico y ácido cítrico sobre varias cepas de A. flavus y registraron resultados similares.
El inhibidor fúngico conformado por la mezcla de ácidos a una concentración de 1000 ppm no
permitió el crecimiento in vitro de A. fumigatus (Figura 1), en el cual se registró una inhibición
del 100 %. La inhibición de crecimiento fue del 26,2 % en la concentración de 100 ppm, y
9,2% a 10 ppm, valores estadísticamente similares a los obtenidos con la concentración de 1
ppm y el control (Tabla 1). El ácido ascórbico resultó eficiente en concentraciones bajas para
controlar ambas especies de Aspergillus, inclusive en concentraciones más bajas de las
permitidas para la conservación de productos alimenticios, que es de 10.000 a 60.000 ppm
(19). El efecto sinérgico de la mezcla de ácidos también fue observado en la inhibición del
crecimiento de A. fumigatus.
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Figura 1. Crecimiento micelial radial (CMR) en cm día
-1
de hongos micotoxigénicos sometidos
a concentraciones crecientes del inhibidor mezcla de ácido ascórbico 67 %, ácido cítrico 16,5
% y ácido láctico 16,5 %.
Como se ha registrado para A. flavus y A. fumigatus, F. verticillioides tampoco presentó
crecimiento micelial en la concentración de 1000 ppm del inhibidor (Figura 1). En el tratamiento
con 100 ppm de la mezcla de ácidos, la inhibición del crecimiento fue solamente del 20,4 %,
y se observó una clara estimulación del crecimiento micelial a concentraciones menores, con
valores más altos que los registrados en el control (Tabla 1). También en F. verticillioides se
observó el efecto sinérgico de los ácidos orgánicos en estudio, los cuales, aplicados por
separado, requieren de altas concentraciones para inhibir el desarrollo de los hongos (20).
4. Conclusiones
El inhibidor conformado por la mezcla de ácido ascórbico al 67 %, ácido cítrico al 16,5 % y
ácido láctico al 16,5 % fue altamente eficaz para la inhibición del crecimiento de A. flavus, A.
fumigatus y F. verticillioides a concentración de 1.000 ppm. Se sugiere realizar más estudios
que incluyan más concentraciones de la mezcla de ácidos orgánicos utilizados en este trabajo,
así como también con otros inhibidores, y posteriormente verificar la viabilidad de uso in vivo.
Contribución de los autores: Todos los autores contribuyeron activamente en el desarrollo
del presente trabajo. Maidana-Ojeda y Cabrera conceptualizaron el trabajo, diseñaron el
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marco metodológico y aplicaron los instrumentos. Medina-Aquino realizó los análisis
estadísticos. Mongelós-Franco y Enciso-Maldonado redactaron el manuscrito.
Conflicto de interés: Los autores declaran que no existe ningún conflicto de interés con
respecto a la publicación de este artículo.
Agradecimientos: A la Universidad Autónoma de Chapingo (México), a la Universidad
Nacional del Nordeste (Argentina), a la Universidad Católica Nuestra Señora de la Asunción
(Paraguay), y al Centro de Desarrollo e Innovación Tecnológica (Paraguay).
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